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制備色譜純化冬凌草活性成分冬凌草甲素
2014-09-02查看:
冬凌草采用95%乙醇熱浸取法保溫回流30min，過濾，提取液經(jīng)濃縮得到粗品冬凌草甲素浸膏。粗品冬凌草...
趙新燕 周建民 秦學(xué)
（聊城萬合工業(yè)制造有限公司，山東 聊城252022）
冬凌草為唇形科植物碎米椏[Rabdosia rubescens(Hamst)C.Y.Wu.et Hsuan]的干燥地上部分，主要分布于我國(guó)黃河流域及其以南各地區(qū)，主產(chǎn)于河南太行山南麓各地。冬凌草具清熱解表、消炎止痛、健胃活血等功效，在抗腫瘤方面有較強(qiáng)的活性。冬凌草甲素為冬凌草的有效活性成分，研究[1]發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在河南濟(jì)源太行山區(qū)8月份冬凌草葉中冬凌草甲素含量最高，它是一種對(duì)映貝殼杉烯二萜類化合物。
冬凌草甲素對(duì)各種移植性腫瘤細(xì)胞具有較大的殺傷，抑制增殖能力，臨床上主要用來治療胃癌、食道癌等癥。冬凌草甲素目前主要從冬凌草植物中分離純化得到，提取方法主要為乙醚提取法、乙醇提取法及中壓柱色譜法等，但這些提取工藝操作周期長(zhǎng)，條件不易控制，得到的冬凌草甲素的含量低[2-5]。
本文采用反相制備色譜法分離純化了冬凌草甲素，分離工藝簡(jiǎn)單，提取率高，所得產(chǎn)品純度高，無污染，為進(jìn)一步工業(yè)化制備型液相色譜分離純化冬凌草甲素提供了基礎(chǔ)。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀含GLP3250泵，可更換泵頭兩個(gè)（250ml）,GLP色譜工作軟件，UC-3292檢測(cè)器；超聲清洗機(jī)，PH測(cè)定儀。試劑：甲醇，純水，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（均為分析純）；冬凌素甲素對(duì)照品由河南醫(yī)科提供經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)純度大于99.5%；冬凌草產(chǎn)自河南濟(jì)源市。
2 制備條件
分析條件：色譜柱（ID4.6×250mm，C18,粒徑5μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（60：40）；柱溫：38℃，流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：239nm；進(jìn)樣體積10μl。
制備條件：色譜柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒徑25~40μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（55:45）；流速：35ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：239nm；進(jìn)樣體積5ml。
3 冬凌草甲素的制備
3.1 樣品的處理
參考文獻(xiàn)[6-7]并考慮到各種成本，選用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行熱回流提取。取冬凌草干草粉末120g，放到預(yù)熱至80℃的1200ml 95%熱乙醇中，保溫回流30min，過濾得提取液。將沉淀再次提取2次，將所有提取液濃縮成膏，即粗品。
3.2 冬凌草甲素的純化
將上節(jié)方法制備的冬凌草甲素粗品用制備條件中的流動(dòng)相配制成體積10mL的溶液，用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，作為制備液備用。在2節(jié)制備色譜條件下開機(jī)，每次進(jìn)樣5ml，收集相應(yīng)的流出液，蒸發(fā)濃縮干燥，得冬凌草甲素白色粉末。
3.3 制備樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定
用萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱取上節(jié)制得的冬凌草甲素5mg，用分析色譜條件流動(dòng)相溶解，定容于25mL容量瓶中，按照反相高效液相色譜測(cè)定法[8]進(jìn)行純度測(cè)定，制備的樣品冬凌草甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%。
4 結(jié)果與討論
4.1 流動(dòng)相的選擇
流速35ml/min，進(jìn)樣量5ml，考察不同組成流動(dòng)相下的分離效果和回收率，結(jié)果如表1所示。由表1可見，隨著溶劑極性的增大，分離度、保留時(shí)間及冬凌草甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，而回收率逐漸減少，綜合分析，選擇甲醇：水為55:45的溶劑體系作為流動(dòng)相。
4.2 流速的選擇
以甲醇-水（55:45）作為流動(dòng)相，進(jìn)樣體積為5ml，測(cè)試了流速分別為20、25、30、35、40、45、50ml/min條件下的樣品分離度、保留時(shí)間及純度，結(jié)果如表2。由表2可見，隨著
表1 流動(dòng)相組成對(duì)分離冬凌草甲素的影響
|
流動(dòng)相組成 V甲醇：V水 |
分離度 /R |
保留時(shí)間 /min |
冬凌草甲素的 質(zhì)量分?jǐn)?shù) w(C20H28O6)/% |
回收率 /% |
|
60:40 |
<1.5 |
3 |
95.6 |
98.5 |
|
55:45 |
>1.5 |
6 |
99.1 |
98.2 |
|
50:50 |
>1.5 |
7 |
99.2 |
97 |
|
45:55 |
>1.5 |
10 |
99.2 |
96.3 |
|
40:60 |
>1.5 |
12 |
99.3 |
96.1 |
表2 流動(dòng)相的流速對(duì)分離冬凌草甲素的影響
|
流動(dòng)相的流速 /(ml/min) |
保留時(shí)間 /min |
分離度 /R |
冬凌草甲素的 質(zhì)量分?jǐn)?shù) w(C20H28O6)/% |
|
20 |
28 |
>1.5 |
99.1 |
|
25 |
12 |
>1.5 |
99.3 |
|
30 |
10 |
>1.5 |
99.3 |
|
35 |
7 |
>1.5 |
99.5 |
|
40 |
5 |
<1.5 |
98.7 |
|
45 |
4 |
<1.5 |
98.3 |
|
50 |
3 |
<1.5 |
97.1 |
流速的增大，冬凌草甲素的保留時(shí)間逐漸減少，分離度降低，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增大后減小，在流速大于35ml/min的條件下，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。綜合考慮分離周期、分離度等，選擇以35ml/min為流動(dòng)相的流速。
4.3 進(jìn)樣質(zhì)量濃度的選擇
以甲醇-水（55:45）作為流動(dòng)相，流速控制在35ml/min，測(cè)試了樣品在不同進(jìn)樣質(zhì)量濃度下的分離效果，結(jié)果見表3.由表3可見，隨著進(jìn)樣質(zhì)量濃度的增大，色譜保留時(shí)間增長(zhǎng)，色譜寬度變大，分離度減小，冬凌草甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。為保證有較高的生產(chǎn)效率，較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選擇進(jìn)樣質(zhì)量濃度為15g/ml。
表3 進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離冬凌草甲素的影響
|
進(jìn)樣質(zhì)量濃度 /[g(生藥材)/ml] |
保留時(shí)間 /min |
分離度 /R |
冬凌草甲素的 質(zhì)量分?jǐn)?shù) w(C20H28O6)/% |
|
5 |
3 |
>1.5 |
92.7 |
|
10 |
5 |
>1.5 |
92.5 |
|
15 |
7 |
>1.5 |
92.6 |
|
20 |
10 |
<1.5 |
92.3 |
|
25 |
13 |
<1.5 |
91.8 |
5 結(jié)論
采用制備液相色譜法分離純化冬凌草甲素，分離效果好，分離周期短，所用溶劑對(duì)環(huán)境無污染。本工藝若120g冬凌草可提取得370mg冬凌草甲素，收率高，可供工業(yè)化生產(chǎn)工藝參考。
參考文獻(xiàn)
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[3] 袁珂,胡潤(rùn)淮,冀春茹,等.柱層析法分離制備冬凌草甲素的新工藝[J] .中國(guó)中藥雜志,1997，22(8):478一482.
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